LAPORAN RESMI
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
“PEWARNAAN SEDERHANA”
Disusun oleh :
Kelompok : A
Mskur Yusup (17113118A)
Dinda Nur M (17113117A)
Galau M E B P M (17113120A)
Vini Karus S (17113246A)
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SETIA BUDI
SURAKARTA
2012
I.
TOPIK
Pewarnaan Sederhana
(pewarnaan positif dan negatif)
II.
ALAT DAN BAHAN
ALAT : Objek glass
Jarum inokulum / ose
Pembakar spirtus
Mikroskop monokular
Tabung reaksi
Pipet tetes
Rak tabung reaksi
BAHAN : Kultur bakteri (Bacillus, Tetracoccus, Providencia, Staphyllococcus)
Aquadest
Spirtus
Pewarna methylen blue, safranin, kristal violet
Kapas
Xylol
Minyak imersi
Tinta cina
III.
CARA KERJA
Pewarnaan positif
1. Bersihkan
obyek glass dengan kapas
2. Jika
perlu tulislah kode nama bakteri pada sudu objek glass
3. Panaskan
ose diatas api hingga membara
4. Putar
kapas penutup tabung aquadest sebelum membuka tabung reaksi dan kemudian tarik
kapas peenutup tabung reaksi yang berisi aquadest. Setelah di buka, panaskan
mulut tabung reaksi dengan api
5. Ambilah
aquadest dengan menggunakan ose yang telah di sterilisasi dengan api, kemudian
oleskan ke tengah - tengah objek glass, lakukan 2-3 kali
6. Sebelum
menutup tabung reaksi panaskan kembali mulut tabung reaksi.
7. Ambilah
bakteri yang telah di kultur di dalam tabung reaksi dengan cara putar kapas penutup tabung
kultur bakteri sebelum membuka tabung reaksi, dan kemudian tarik kapas penutup
tabung reaksi yang berisi kultur bakteri. Setelah di buka, panaskan mulut
tabung reaksi dengan api. Masukan ose
yang telah di stirilisasi untuk mengambil bakteri dengan cara mengoleskan ke
permukaan kultur bakteri dan oleskan pada objek glass, tepat diatas permukaan
aquadest yang telah diteteskan sebelumnya pada objek glass yang sama, putar dan
ratakan bakteri dengan air hingga sedemikian rupa membentuk lingkaran kurang
lebih berdiameter 1 - 2 cm
8. Fiksasi
perparat yang telah diolesi bakteri tersebut di atas api sampai kering.
9. Setelah
benar – benar kering, genangilah objek glass yang berisi ulasan bakteri
tersebut dengan cat pewarna ( methylen
blue, safranin, crystal violet ) selama kurang lebih 30 detik
10. Setelah
30 detik cucilah denggan air mengalir dan keringkanlah kembali ulasan yang masih
basah di atas api.
11. Amatilah
ulasan dibawah mikroskop dengan perbesaran
lemah, setelah fokus teteskan minyak emersi tepat diatas preparat dan ganti
lensa obyektif dengan perbesaran kuat 100x.
Pewarnaan negatif
1. Sediaakan
objek glass sebanyak 2 buah, bersihkan objek glass dengan spirtus atau alkohol
supaya objek glass yang akan kita pakai terbebas dari lemak.
2. Teteskan
nigrosin ( tinta cina ) pada ujung kanan dari salah satu objek glass.
3. Ambil
ose dan kemudian sterilisasi ose tersebut dengan cara memanaskan ujung ose di
api spirtus sampai membara.
4. Ambilah
tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, putar terlebih dahulu sebelum menarik
penutupnya, panaskan mulut dari tabung reaksi sebelum mengambil bakteri dengan
ose, setelah dipanaskan ambil kultur bakteri dengan ose. Sebelum menutup
panaskan kembali mulut dari tabung kultur.
5. Oleskan
kultur dari bakteri yang telah kita ambil dengan ose tepat pada tinta cina yang
kita teteskan di ujug kanan objek glass.
6. Tempelkan
sisi objek glass yang lain tepat pada tinta cina dengan posisi objek glass
membentuk sudut 45o.
7. Geser
objek glass yang kita tempelkan di atas tinta cina tersebut ke arah kiri,
pastikan bahwa ada bagian yang cukup tipis dari olesan tinta tersebut agar
dapat diamati dengan mudah.
8. Keringkan
tinta cina tersebut diatas api sehingga cepat mengering.
9. Setelah
kering lakukan pengamatan dengan mikroskop menggunakan perbesaran lemah 10x.
Setelah tercapai titik fokus ganti lensa objektif dengan perbesaran sedang 40x.
IV.
DASAR TEORI
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan
hidup sangatlah sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan
dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati.
Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang
paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Macam-macam pewarnaan antara lain :
1.
Pewarnaan sederhana
Pewarnaan
sederhana merupakan pewarnaan dengan menggunakan satu jenis pewarna saja dengan
tujuan untuk mengetahui morfologi (coccus, basil, vibrio, spiral) dan susunan
selnya (rantai, bergerombol, berpasangan, tetrad) Pewarnaan ini dapat
menggunakan pewarna basa pada umumnya, antara lain : kristal violet, metylen
blue, karbol fuchsin, dan safranin.
·
Pewarnaan negatif
Bakteri
tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang
sulit diwarnai, seperti Spirochaeta.
·
Pewarnaan positif
Sebelum
dilakukan pewarnaan positif hendaknya membuat ulasan diatas objek glass,
kemudian difiksasi. Ulasan jangan terlalu tebal karena akan mempersulit mencari
bakteri dalam pengamatan dengan mikroskop.
2.
Pewaraan diferensial
Pewarnaan
ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi menjadi dua, yaitu
pewarna gram dan pewarna tahan asam (acid fast). Selain itu juga digunakan
untuk visualisasi struktur.
·
Pewarnaan gram
Pewarnaan
gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram
positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal
violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta
safranin sebagai gram D.
·
Pewarnaan acid fast
Pewarnaan
ini digunakan untuk membedakan bakteri yang tahan terhadap larutan asam dan
yang tidak tahan terhadap larutan asam. Reagen yang digunakan dalam pewarnaan
acid fast terdiri dari cat utama, peluntur alkohol asam, dan cat lawan /
tanding.
3.
Pewarnaan khusus
Untuk mewarnai struktur khusus dari
bakteri seperti kapsul, spora, flagel dll
·
Pewarnaan kapsul
Pewarnaan
ini mengunakan dua reagen, yaitu: kristal violet sebagai dekolorisator
(penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai pewarna tandingan
teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi. Hasil pewarnaannya
ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna ungu gelap dari
sel.
·
Pewarnaan spora
Pewarnaan
spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit green dan safranin, yang
dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna
merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus subtilis.
V.
HASIL PENGAMATAN
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
VI.
PEMBAHASAN
a.
Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan
sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian
karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme.
Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmaanya bersifat basofil (suka basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat
positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan
bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, bacillus, strepto cocus dll)
dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui
bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk
pewarnaan sederhana ialah methylen blue, kristal violet, dan safranin.
Sel-sel
mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir transparan bila
diamati dengan mikroskop cahaya biasa sehingga sukar dilihat, karena sitoplasma
selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya
yang bersifat cair. Kontras antara sel dengan lingkungannya dapat dipertajam
dengan mewarnai sample tersebut. Tujuan pewarnaan adalah untuk mengamati dengan
lebih baik morfologi mikroorganisme secara kasar, mengidentifikasi
bagian-bagian struktural sel mikroorganisme dan membantu mengidentifikasi atau
membedakan mikroorganisme yang serupa.
b. Pewarnaan
negatif
Pewarnaan negatif adalah pewarnaan yang memakai bahan
pulas yaitu tinta-cina (nigrosin), karena itu sering juga disebut pewarnaan
tinta-cina. Pewarnaan ini dipakai untuk mengetahui adanya golongan
spirochaetales dan juga untuk memperlihatkan adanya selubung (kapsul) pada
kuman-kuman yang tertentu seperti pada Diplococcus pneumoniae, Klebsiella
Frielander, dll.
Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang tidak
langsung. Kita hanya mewarnai latar belakang dari bakteri tersebut, sedangkan
bakterinya sendiri tidak mengambil zat-zat warna. Pada negatif staining pada
umumnya tidak dilakukan ”fiksasi”, maka praktis bakteri tidak mengalami
perubahan-perubahan, tidak mengerut. Dengan demikian pewarnaan negatif berguna
untuk melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya serta berguna untuk
pengukuran-pengukuran bakteri.
Pada pewarnaan bakteri ini
sel-sel kuman kelihatan ”transparan” (terang jernih) sedangkan latar
belakangnya kelihatan gelap (dengan tinta-cina).
c. Pewarnaan
sederhana dan negatif pada bakteri basilus,streptococus,providensia,
Dalam
pewarnaan sederhana yang dipergunaakan dalam praktikum, digunakan biakan
bakteri yang telah dikultur dan diwarnai dengan pewarna – pewarna seperti methylen blue, safranin, dan cristal violet.
Masing – masing dari pewarna tersebut memberikan warna – warna yang berbeda,
pewarnaan sederhana akan merubah warna dari bakteri sesuai dengan warna cat
yang kita beri kepada bakteri tersebut. Methylen
blue akan memberikan warna biru muda,
safranin akan memberikan warna merah
muda dan cristal violet akan memberikan
warna ungu pada bakteri.
Dalam proses isolasi enzim untuk
di diamati dan dilakukan suatu pengecatan, pastikan bahwa praktikan harus steril
karena bakteri yang akan kita amati adalah bakteri yang patogen, sehingga dapat
mengakibatkan terkontaminya bakteri kepada praktikan, jadi pastikan bahwa
praktikan dan alat – alat yang digunakan dalam keadaan yang steril. Dalam
sterilisasi praktikan sebaiknya menyemprotkan alkohol pada kedua tangan
terlebih dahulu, memakai hand glove (sarung tangan) dan masker sebelum memulai
praktik untuk memimalisir kontaminasi dari bakteri. Ose yang digunakan harus
dipanaskan hingga membara sebelum untuk mengambil biakan bakteri, hal ini
bertujuan agar bakteri yang ada di ose tersebut mati dan bakteri yang terambil
dengan ose di dalam tabung kultur adalah bakteri yang sesuai. Dalam proses
pengambilan bakteri usahakan dekat dengan api entah itu di depan api atau di
belakang api ini bertujuan agar tidak terkontaminasi dengan bakteri yang berada
di udara karena di sekitar api bakteri akan mati tetapi jagan terlalu dekat
karena akan merusak struktur dari bakteri tersebut. Sebelum pengecatan lakukan
fiksasi terlebih dahulu yang bertujuan agar bakteri menempel pada objek glass. Pengucuran
air kran bertujuan agar lapangan pandang menjadi transparan.
Dalam pewarnaan negatif kita
dapat membedakan dengan pewarnaan sederhana dari segi warna yang ada, dalam
pewarnaan sederhana yang berubah warna adalah bakteri tersebut dan pewarnaan
negatif adalah latar belakang yang menjadi gelap, dan bakteri akan tapak
seperti bintang – bintang putih transparan. Pastikan bahwa dalam pewarnaan
negatif terdapat usapan yang cukup tipis sehingga dapat diamati. Pada saat
pemerataan, setelah mengambil bakteri dari tabung kultur pastikan bahwa kita
mengusapkan ose yang ada bakteri ke tinta cina secara merata, tujuannya adalah
ketika kita mengamati bagian yang tipis dari pengecatan negatif, terdapat
bakteri di tempat yang tipis tersebut.
VII.
KESIMPULAN
·
Pewarnaan
mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara yaitu dengan pengecatan sederhana
dan pengecatan negative dll
·
Pewarnaan
sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan
menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin, kristal violet, methylen
blue
·
Pewarnaan dari bakteri akan memberikan
penampilan baru dalam pengamatan bakteri
·
Sterilisasi dari alat dan praktikan
sangat penting peranannya dalam pengamatan
·
Fiksasi
adalah teknik yang dilakukan supaya smear bakteri tidak tercuci selama prosedur
pewarnaan. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang
dikering-anginkan dua-tiga kali pada api bunsen
VIII.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim.
2009.http://www.microbiologybytes.com/video/Pputida.html. Dwidjoseputro, D.,
1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.
Ekmon, 2008. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi- bakteri.html)
Ekmon, 2008. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi- bakteri.html)
Jimmo., 2008. http ://Pembuatan PreParAT dannn
PengeCaTAnnyA__ BloG Kita.mht ,.
diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:29.
Campbell, N. A. Dan Reece, J.
B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar